葡萄的质量受到低温胁迫的显著影响，而耐寒的野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制对于葡萄的遗传改良至关重要。WRKY转录因子在冷胁迫的响应中扮演着重要角色，通过与W-box元件结合调控次生代谢和碳水化合物合成等过程。

在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），将淀粉分解为可溶性糖，从而调节渗透压，稳定细胞结构，并直接调控过氧化物酶（VaPOD36），清除活性氧（ROS），增强植物的耐寒性。然而，VaWRKY系列基因在葡萄耐寒过程中的具体功能和机制仍需深入探讨。

最近，《Horticulture Research》期刊发表了一项研究，指出VaWRKY65在冷胁迫条件下，通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制，能够有效增强葡萄的耐寒性。特别是，VaWRKY65激活VaBAM3，促进可溶性糖的积累，调节细胞渗透压；同时，也激活了VaPOD36的转录，清除活性氧（ROS），为葡萄提供了双重的耐寒保障。

研究还表明，通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，发现VaBAM3启动子的活性在冷处理后显著上升。使用酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制。研究结果表明，VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子的活性来调节耐寒性，而相应的启动子突变则抑制了这一效应。

此外，研究团队还利用双荧光素酶系统，展示了VaWRKY65在冷胁迫条件下对ROS的调控机制。结果显示，VaWRKY65结合并激活VaPOD36的表达，上调VaPOD36可提高POD酶活性，增强抗氧化能力，进而减少ROS的积累，从而提升植物的耐寒性。

实验采用的方法包括将基因启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合，转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体导入本氏烟草叶片，经过2天的共培养后，在低温下培养72小时。观察LUC荧光时，喷洒1mM D-荧光素溶液，黑暗放置5分钟，以使用勤翔IVScope7000植物活体成像系统进行检测并分析数据。

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